技 术 简 报
第 30 期
国家苹果产业技术体系 2022 年 9月 14 日
苹果无糖组织培养技术
遗传改良研究室 张 东 毛江萍 邢利博 安 娜 马娟娟
植物无糖组织培养技术(Suger-free Tissue Culture Technology)是日本千叶大学古在丰树（Toyoki Kozai）教授于 20 世纪 80 年代末期提出的，该技术是一种将环境控制技术和组培技术的有机结合的全新的植物组织培养模式，可以显著提高试管苗的质量和产苗率，缩短培养周期，借助无糖组织培养技术大量繁殖优质种苗可有效提高繁殖系数和经济效益，已广泛应用于无性繁殖的种苗产业化实践中。
组织培养是苹果矮化砧木无性繁育的重要方式之一，传统的组织培养技术生根表现为不稳定、炼苗移栽成活率不稳定，成本难以控制，而无糖生根培养技术可以提高生产效率节约时间、提高苹果组培苗移栽的成活率、降低生产成本，并且因其污染率低操作方便、根系健壮，可以实现大型培养容器生根育苗。2017 年以来，国家苹果产业技术体系苗木繁育与栽培方式岗位研究建立了无糖组培快繁技术，已成功用于 30 余个苹果品种、砧木和杂交砧木优系繁育，现将该技术的关键操作步骤进行总结，不同品种和砧木的生根效果存在一定差异，应用时需酌情调整。
组织培养是苹果矮化砧木无性繁育的重要方式之一，传统的组织培养技术生根表现为不稳定、炼苗移栽成活率不稳定，成本难以控制，而无糖生根培养技术可以提高生产效率节约时间、提高苹果组培苗移栽的成活率、降低生产成本，并且因其污染率低操作方便、根系健壮，可以实现大型培养容器生根育苗。2017 年以来，国家苹果产业技术体系苗木繁育与栽培方式岗位研究建立了无糖组培快繁技术，已成功用于 30 余个苹果品种、砧木和杂交砧木优系繁育，现将该技术的关键操作步骤进行总结，不同品种和砧木的生根效果存在一定差异，应用时需酌情调整。
一、无糖组培技术概念与原理
无糖组织培养技术，也称为光自养微繁殖技术，是指在植物组织培养中改变植株所需碳的来源，使用不含糖的培养基，以 CO 2 代替糖作为碳源，通过控制影响试管苗生长发育的环境因子，促进植株光合速率，使试管苗由异养型转变为自养型，以更接近植物自然生长状态、成本相对较低的方式生产优质种苗的一种组织培养技术。该技术将整个培养环境看作是一个微型的生态系统，将大田温室建设中的环境控制原理引人到组织培养室改造应用中，有效地解决了生产中经常出现的试管苗再生能力差、污染率高等问题。
广义的植物无糖组织培养技术包括无糖培养微繁殖和闭锁型种苗生产两种类型。无糖培养微繁殖又称光独立培养微繁殖
（Photoautotrophic Micro Propagation)，指由 CO 2 代替糖作为植物体的碳源，以减少微生物的污染，使植株自养进行光合作用，从而促进植株快速生长和发育。闭锁型种苗生产是指在一个封闭的系统中，通过控制其营养液、光照、温度、湿度、CO 2 及各种气体的浓度，为植物的生长创造最佳的环境条件。所产生的种苗健壮、整齐、品质好,生产周期短,可以直接移栽到大田，而不再进行驯化阶段，从而能有效防止农药、化肥污染，节约土地资源和能源，保护生态环境，降低生产成本。
无糖组织培养技术理论上适用于所有植物，包括草本植物、藤本植物、木本植物、C3 植物、C4 植物和 CAM 植物。到目前为止,植物无糖组织培养技术已在数十种植物上应用取得成功。
二、无糖组培技术特点与优势
无糖组培技术与常规组培技术的不同之处在于改变了碳源的供给途径，即改变培养基成分，培养基中不再含有糖；组培苗培养容器改为箱式大容器培养；输入可控制量的 CO 2 气体作为碳源，并通过控制培养环境因子，促进植株光合作用速率，使之由异养型转变为自养型，因而可使植株长势良好，生物量较有糖培养的显著增加，污染率明显降低。在传统的组培快繁技术中，培养基中糖的存在容易导致植物的微生物污染，造成植株生根率低、生长发育延缓或死
亡、移栽苗成活率低，导致生产成本较高，严重地制约了离体快繁的规模化与商业化应用。
植物无糖组织培养与传统植物组织培养相比具有如下一些优点:1）通过人工控制动态调整优化植物生长环境，为种苗繁殖生长提供最佳的 CO 2 、浓度、光照、湿度、温度等环境条件，促进了植株的生长发育，苗齐、苗壮，培养周期缩短了 40%以上。2）大幅度减少了植物组培生产过程中的微生物污染率；植株的生根率和成苗率显著提高，使得种苗驯化期间的成活率大幅度上升，并使复杂的驯化过程得以简化。3）节省投资，降低生产成本:与传统的微繁殖技术相比,种苗生产综合成本平均降低 30%。4）组培生产工艺的简单化，流程缩短，技术和设备的集成度提高，降低了操作技术难度和劳动作业强度，更易于在规模化生产上推广应用。5）消除了小植株生理和形态方面的紊乱，种苗质量显著提高。
三、苹果无糖组织培养关键技术环节
1. 材料的选择
生长30 d左右的苹果组培苗。要求生长较健壮（高度2.0 - 3.0 cm），且生长势一致，即要求组培苗达到一定的高度和健壮度，用于无糖组培生根。
2. 操作步骤
（1）组装无糖培养盒，并将蛭石放入 121℃高温高压灭菌锅中灭菌 21 min，取出后在 65℃烘干箱中烘干（或者自然晾干），在相对密闭干净的条件下称取 1.5- 2 L/盒；配置生根营养液 800 - 1000 ml/盒，营养液配方为：1/2MS + 0.5 - 1.5mg/L IBA，pH=5.8 左右。
（2）在密闭干净条件下，将上述步骤准备的蛭石和营养液倒入无糖培养盒中，混匀，得到含水量 70%左右的无糖培养基质。
（3）在超净工作台上进行生根接种，选取生长 30 d 左右、高度2cm 以上，带有 3 片及以上叶片、长势良好的苹果组培幼苗，切除愈伤组织和底部叶片，接种到无糖生根培养基质中，接种完成后用小喷壶喷施无糖盒生根专用抑菌剂，并用 10 cm 宽的保鲜膜对盒子接缝进行密封。如外植体不需要重新接种回无菌组培瓶中，生根接种可无需在超净工作台上进行。
（3）在超净工作台上进行生根接种，选取生长 30 d 左右、高度2cm 以上，带有 3 片及以上叶片、长势良好的苹果组培幼苗，切除愈伤组织和底部叶片，接种到无糖生根培养基质中，接种完成后用小喷壶喷施无糖盒生根专用抑菌剂，并用 10 cm 宽的保鲜膜对盒子接缝进行密封。如外植体不需要重新接种回无菌组培瓶中，生根接种可无需在超净工作台上进行。
（4）将接种好的组培苗盒子在无糖培养专用培养架上，通入 CO 2气体，黑暗培养 3 d，3 d 后正常进行光照。
3. 培养条件
对接种好的待生根苗子，放置在光照 12 h/d，室温 23 - 25℃，光强 2000 - 4000 lx 的环境下进行无糖生根培养，生根培养时间为 25-30d。生根期间无糖组培生根室湿度保持在 80%左右，二氧化碳气体控制在 800 - 1200 ppm。
图 1 无糖组培间 图 2 无糖组织培养设备与生根接种操作
图 3 苹果砧木无糖组培生根效果及移栽缓苗
